De museumbewaker Larry (Ben Stiller) gaat terug naar het museum waar hij ooit de meest tragische nacht van zijn leven had. Tot zijn verbazing ziet hij dat zijn favoriete museumstukken ingepakt staan om verhuisd te worden naar de archieven van een ander museum. Als Larry een wanhopig telefoontje krijgt van de miniatuur-cowboy Jedediah (Owen Wilson), besluit hij actie te ondernemen om te voorkomen dat de kwade Kamunrah het museum en uiteindelijk de hele wereld overneemt!

De film is Nederlands ondertiteld.